口碑好的白癜风医院 http://wapyyk.39.net/bj/zhuanke/89ac7.html摘要：骨关节炎（OA）是中老年人常见的慢性疾病，以软骨退行性损伤为主要病理变化。在世界范围内普遍流行[1]。针对OA多种多样的病因和发病机制，目前的预防和疾病缓解策略存在许多弊端。基因组编辑技术的进步可能会通过解决遗传易感性危险因素和炎症调节剂的活性来改善疾病缓解方案。针对OA中遗传和表观遗传的CRISPR/Cas9和基于细胞的基因组编辑疗法等技术的最新进展为早期诊断和个性化疗法的发展提供了有希望的途径。这篇综述的目的是简要概述针对诸如OA等疾病的基因组编辑技术[2]。关键词：基因组编辑骨关节炎CRISPR—Cas9
1.当前治疗的局限性
骨关节炎的治疗目的主要是缓解症状，减缓病情进展，保持关节正常功能。治疗方法多种多样，包括非药物治疗、药物治疗、手术治疗。关节内注射类固醇和关节镜灌洗并清创短期有轻微好处，却无法长期发挥作用[3]；抗炎、镇痛药物可能有助于解决OA的一些症状，但会引起长期使用相关的显著副作用，且不能解决不可逆转的退行性病变中的基本病理现象[4]；手术和关节置换，短期有效，但时效短需要多次替换，因此也不是OA治疗和预防的高效策略[5]。
与导致骨性关节炎的根本原因作斗争的最好办法是利用基因组编辑技术。越来越多证据表明，遗传和表观遗传修饰在骨性关节炎中发挥实质性作用，但较难将个体效应、遗传、环境因素共同作用导致的关节退化的综合效应区分开[6]。因此，遗传因素将会是未来诊断、预后和开发新的治疗靶点的关键因素，也是为未来的个性化生物治疗提供新治疗靶点的必要因素。
2.CRISPR/Cas
CRISPER/Cas是一种新颖且有前途的基因组编辑技术，在高效治疗OA等其他退行性关节疾病方面已有了较多研究，未来也有更多新的可能。原核生物CRISPR/Cas系统有三个主要成分:一个Cas核酸酶、一个CRISPRRNA和一个反式激活crRNA（tracrRNA）。在细菌细胞中，CRISPR/Cas系统的工作原理是识别入侵的噬菌体DNA，将其切成几段，并将其并入其DNA中。然后这些CRISPR片段被转录，产生一个crRNA和一个tracrRNA，从而产生一个双链RNA结构，可以吸收Cas蛋白质。当再次遇到攻击噬菌体时，CRISPR/Cas系统将被导向外源DNA上的一个特定位置，因为在crRNA靶向序列的上游有一个邻接基序(PAM)短核苷酸碱基序列。Cas蛋白质被设计成“分子剪刀”进行切割、剪接和所需的任何其他编辑的系统[7]。CRISPR/Cas的治疗应用如图1所示。
图1CRISPR/Cas机制。反转录RNA(橙色)与CRISPRRNA(蓝色)引导RNA。引导RNA与Cas9蛋白结合形成CRISPR复合物。利用引导RNA的特异性，CRISPR复合体结合到目标DNA上。转基因DNA可以使用同源臂插入。
在CRISPR/Cas系统的六种主要类型中，应用最广泛的II型系统是从化脓性链球菌中衍生出来的。Cas9蛋白工作范围广，效率高，因此被广泛使用。
3.间充质干细胞与组织再生
一般来说，关节软骨的组织再生和自我更新是一个非常有限的过程。关节软骨的无血供可能阻碍祖细胞到达受损软骨的部位。它也可能限制了对细胞外基质修复和体内平衡至关重要的分子因子[8]。
软骨细胞可以来源于间充质干细胞（MSCs）。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)由于靠近关节、高分化能力以及分泌不同生长、抗炎和免疫调节因子的能力，在帮助关节软骨修复方面前景广阔[9]。它们可以影响关节疼痛和功能的临床相关改善。然而，还需要更多的研究来证明培养的骨髓间充质干细胞与非培养的骨髓间充质干细胞的疗效以及将其送入关节的最佳方式。骨髓间充质干细胞的功能通常与年龄有关。间充质干细胞的寿命较短，但可分泌可能对组织再生有益的旁分泌因子[10]。除了BM-MSCs外，来源于脂肪组织等其他部位的MSCs也可被分离、扩增、鉴定并用于软骨再生；然而，间充质干细胞倾向于形成机械性的下纤维软骨，而不是覆盖在关节骨末端的玻璃状、透明的软骨[11]。
3.1细胞外囊泡
基因编辑因子，包装在工程CRISPR/Cas9复合物中，可被包裹在细胞外囊泡(EVs)中，并被递送到特定的靶细胞。EVs由脂质、蛋白质、RNA和DNA等细胞成分组成，EVs可以穿过血脑屏障，在体内靶向细胞，保护其成分不被循环系统降解[12]。它们的功能依赖于它们的来源，来自MSC的EVs可能具有将内容物传递到OA细胞的潜力，如图2所示[13]。
图2细胞外囊泡传递CRISPR/Cas9治疗OA。在一个生产细胞内(左)，可能发生以OA为靶标的sgRNA转录。SgRNA与Cas9结合形成CRISPR/Cas9SgRNA复合物。CRISPR/Cas9复合物负载到细胞外囊泡的荧光标记含有二聚结构域，与工程CRISPR/Cas9复合物的二聚结构域兼容。这些荧光标记也包含靶骨关节炎细胞的靶点(右)。装载的EVs附着在目标细胞上并卸载CRISPR/Cas9复合物，然后将其运送到细胞核中执行。
外泌体作为一种非选择性细胞系统的使用可能有局限性，包括将内容物传递到非目标细胞。外源性细胞治疗可通过传递软骨细胞(自体或异体)、间充质干细胞(MSCs)或细胞外囊泡来实现。骨髓间充质干细胞被用于再生医学，因为它们能够根据损伤部位的环境信号促进再生。作为免疫系统的抑制因子和多系分化因子，间充质干细胞是一种重要的选择关节软骨修复和再生的细胞来源[14]。在小鼠中进行的体外研究表明，微颗粒和外泌体(源自间充质干细胞的EVs)发挥类似的软骨保护和抗炎功能，保护小鼠免于骨关节炎的发生，并重现减轻症状的主要治疗作用[15]。因此，治疗OA的组合方法可能是可行的。3.2潜在CRISPR/Cas分子靶标
细胞治疗有很大的潜力帮助治疗OA，但炎症可以阻止新的关节软骨形成后，引入干细胞。炎症和炎症调节因子在OA治疗中必须被重视，这些炎症调节因子可能作为CRISPR/Cas9策略的靶点[16]。表1列出了CRISPR/Cas9编辑的潜在靶点，以及在使用CRISPR/Cas9技术治疗OA方面取得进展的实验室。IL-1是一种主要由中性粒细胞分泌的促炎细胞因子。IL-1细胞因子诱导许多与OA相关的基因和其他细胞因子的表达，包括肿瘤坏死因子(TNF-α)。目前的OA疗法以TNF-α为靶标，但是由于TNF-α在促进许多其他功能中的作用，因此会产生有害的副作用。暴露于TNF-α的人类关节软骨(hAC)显示出白细胞介素IL-1的表达水平升高。从软骨中分离hACs，使用CRISPR/Cas9敲除IL1-R1受体，并插入一个霉素耐药基因，以便选择敲除细胞。扩增敲除细胞的菌落，并暴露于重组IL-1TNF和IL-1细胞瘤(TNF)，以评估其反应。结果显示，如预期的那样，加入重组IL-1蛋白的实验组炎症反应升高到高水平。然而，在敲除组中，暴露于重组IL-1蛋白没有引起可测量的炎症。因此，在再次注射入体内之前，体外关节软骨细胞中IL1-R1的治疗性敲除可能提高细胞治疗效果[17]。
3.3其他新兴靶标
虽然人们将重点放在软骨和维持关节软骨的软骨细胞上，但人们普遍认为，OA不仅仅是软骨的疾病，而是整个关节的疾病，而且关节内的所有特定组织类型都发挥着重要作用。骨钙素是由成骨细胞分泌的一种小的蛋白质激素，近年来人们对其内分泌功能进行了研究，其影响多种生理过程。Lambert及其同事在年的研究中发现，将CRISPR/Cas9技术应用于骨钙素表达，可以改善大鼠模型系统的骨生物力学，增加骨小梁[18]。
使用CRISPR/Cas9技术已经确定了其他潜在的治疗靶点。例如，大鼠软骨细胞中透明质酸合酶2(HAS2)的CRISPR/Cas9敲除表明了糖胺聚糖透明质酸对于保持聚集蛋白聚糖的重要性，聚集蛋白聚糖是关节软骨功能完整所必需的一种蛋白聚糖[19]。因此，CRISPR/Cas9除了可能被用作直接治疗外，还可以提供有关健康关节组织所需的分子机制的基本信息。
4.局限性和未来考虑
CRISPR/Cas9系统正在广泛的应用和许多研究中得到应用。然而，尽管它在短时间内迅速崛起，并在医学和其他领域有潜在的应用，它像其他基因组编辑工具一样，也有一些限制和顾虑，包括伦理和其他方面。其中限制之一是有效的靶向范围需要进一步研究。
MicroRNAs(miRNAs)是一种小型的非编码RNA分子，可能有助于调节炎症，促进MSC分化，并确保软骨内环境的稳定[20]。所以，miRNAs可与CRISPR/Cas9和EVs联合使用，从而设计出具有针对性的治疗OA的多种方法。
5.结论
世界各地的研究人员正在努力了解退行性关节疾病如OA，进而可以设计出改变或修改影响关节软骨的相关基因的方法，未来将会开发出成功、安全、有效的疗法来阻止、治疗、甚至防止人类OA和其他衰弱性关节疾病的发生。CRISPR/Cas9、MSCs、EVs和miRNAs可能在未来的治疗中发挥关键作用。
参考文献
[1]马笃*,彭力平,陈锋,蒋顺琬,姜劲挺,高坤,林展鹏.基因编辑技术在骨关节炎基因治疗中的作用与意义[J].中国组织工程研究,,25(02):-.
[2]TanikellaAS,HardyMJ,FrahsSM,etal.Emerginggene-editingmodalitiesforosteoarthritis[J].IntJMolSci,,21(17).
[3]Anandacoomarasamy,A.;March,L.Currentevidenceforosteoarthritistreatments.Ther.Adv.Musculoskelet.Dis.,2,17–28.
[4]Ghouri,A.;Conaghan,P.G.Treatingosteoarthritispain:Recentapproachesusingpharmacologicaltherapies.Clin.Exp.Rheumatol.,37,–.
[5]Palsis,J.A.;Brehmer,T.S.;Pellegrini,V.D.;Drew,J.M.;Sachs,B.L.Thecostofjointreplacement
